Engineering-B-Zellen zu express Erreger-spezifische Antikörper zum Schutz gegen Infektionen
Antikörper sind derzeit in Verwendung zur Behandlung von Krankheiten, von Krebs, Autoimmunität und sind in der Regel verabreicht, um die Patienten in mehreren Dosen, ähnlich wie Medikamente. Jedoch, die Produktion und Lagerung von Antikörpern sind vergleichsweise teurer, mit großem Interesse auf der Suche nach alternativen Strategien, diese zu liefern.
In einer aktuellen Studie, Howell F. Moffett und ein interdisziplinäres team in den Bereichen Globale Gesundheit, Immunologie, Impfstoffe und Infektionskrankheiten in den USA entwickelt, sowohl in menschlichen und murinen (Maus) B-Zellen im Labor. Sie konstruierten die Zellen zu express-Antikörper, die gezielt eine Reihe von Viren einschließlich respiratory-synctial-virus (RSV). Die Wissenschaftler zeigten, dass eine einzelne Injektion von B-Zell-Ausdruck von RSV-spezifischen Antikörpern in Mäusen, denen T-und B-Zellen zu schützen. Diese neue Technologie jetzt in der Wissenschaft der Immunologie, wird die Möglichkeit offen, mit engineered-B-Zellen als Therapeutika in der Gesundheitsversorgung.
Wirksame Impfstoffe sind derzeit nicht verfügbar für lebenslangen Schutz gegen viele Infektionen wie beispielsweise RSV, HIV, influenza-virus und Epstein-Barr-virus (EBV), trotz jahrzehntelanger Forschung. In der vorliegenden Arbeit, Moffett et al. eingeführt, eine alternative zu einem Impfstoff durch die Entwicklung einer genetischen Strategie mithilfe von CRISPR-Cas9 (gruppierte regelmäßig interspaced kurze Palindrom wiederholt und Cas9-protein), die mit der Technik zu ersetzen endogen kodierte Antikörper von primären humanen B-Zellen mit Antikörpern, die den Gegner RSV, HIV -, influenza-oder EBV statt.
Sie beobachtet die effiziente expression der Antikörper entwickelt, die in primären B-Zellen unter der Kontrolle der endogenen regulatorischen Elemente, um anzuzeigen, intrazelluläre Kompatibilität. Die Zellen bleiben auch normalen Antikörper-expression und-Sekretion. Mit dem engineered Maus-B-Zellen, zeigten Sie, wie ein transfer von B-Zellen entwickelt, um auszudrücken, einen Antikörper gegen die Erkrankung der Atemwege RSV resultierte in starke und dauerhafte Schutz in RAG1 – defizienten Mäusen. Der vorliegende Ansatz bietet die Möglichkeit, zu erreichen, sterilisieren Immunität gegen Krankheitserreger, wo herkömmliche Impfstoffe haben bisher versäumt, zu induzieren oder aufrechtzuerhalten schützende Antikörper-Antworten.
Schützende Impfstoffe reduziert haben, die menschliche Sterblichkeit von mehreren Infektionskrankheiten durch Aktivierung der humoralen Immunantwort für die spätere Produktion von high-affinity, pathogen-spezifische Antikörper erzeugen, B-Zellen. Doch die Forschung Bemühungen sind noch im Gange, um einen Schutz gegen Krankheitserreger, die Ursache einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich des RSV, einen gemeinsamen Erreger, eine Infektion der oberen und unteren Atemwege. Das virus hat eine lebensbedrohliche Wirkung auf Kleinkinder, ältere Menschen, Personen mit Herz-Kreislauf-Krankheit, und diese sich hämatopoetische Stammzell-Transplantationen.
Obwohl mehrere Varianten der RSV-Impfstoffkandidaten wurden entwickelt, 1966 und 2016, Sie waren nicht in der Lage, zu eruieren, einen längeren Schutz-Reaktion. Wissenschaftler sind derzeit auch die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern ähnlich Schutz gegen HIV, influenza-virus, Epstein-Barr-virus (HBV), humanes metapneumovirus-virus (HMPV), dengue-Fieber, Zika-virus, Ebola-virus und viele andere high-risk-Erreger. Schützende Impfstoffe in der Regel zu entlocken sowohl langlebige B-Zellen und Antikörper-sezernierenden Plasmazellen, in denen Gedächtnis-B-Zellen exprimieren eine membrangebundene form des Antikörpers. Diese ermöglichen den Zellen, um schnell reagieren und differenzieren sich in weitere Antikörper-sezernierenden Zellen während der Infektion.
Moffett et al. entwickelt ein Gentechnik-Strategie zu imitieren, die eine effektive B-Zell-Antwort, die es erlaubt, die expression von schützenden Antikörpern gegen RSV, HIV -, influenza-oder EBV-Infektion in der Maus oder menschlichen B-Zellen in der Anwesenheit von endogenen regulatorischen Elementen. Die voll funktionsfähige B-Zellen benötigen in der Regel alternative splicing and polyadenylation zu produzieren membrangebundene und sezernierte Antikörper; ein schwieriger Prozess, um zu rekapitulieren, die in einem viralen transgens. Hinzufügen einer anderen Ebene der Komplexität, die Antikörper sind in der Regel hergestellt mit zwei Genen; die schwere Kette-gen (IgH; Immunoglobin-heavy-chain locus) und entweder der kappa (Igk) – oder lambda (Igλ) light-chain-gen. Targeting der IgH-locus ist eine komplizierte Aufgabe aufgrund seiner großen Größe und extreme genetische Heterogenität innerhalb von Antikörper-exprimierenden B-Zellen.
Der IgH-locus umfasst Segmente der V – (variable), D (diversity), J (joining) – und C (constant) Unterziehen Rekombination Ereignisse auf der Ebene der DNA während der B-Zell-Entwicklung in jeder Zelle. Die bisherige Forschung versucht hatte entweder ersetzt die schwere region oder Licht region des IgH-locus auf genetisch Ingenieur-B-Zellen. In der vorliegenden Arbeit, Moffett et al. kombiniert die beiden vorherigen Techniken durch die Entwicklung eines single-cut-Ansatz zum einfügen eines genetischen Konstrukts in eine intronic-region (nicht-kodierende region ein RNA-Transkript) des IgH-locus. Mit diesem Ansatz, Sie effizient entwickelt, sowohl in murinen und humanen Zellen.
Zu erreichen one-hit-insertion, die Wissenschaftler entwickelt, der eine entwickelt monoklonale Antikörper (emAb) Kassette mit einem IgH-Promotor. Im folgenden Schritt, Moffett et al. gentechnisch veränderte Konstrukte zu ermöglichen emAbs ausgedrückt werden innerhalb von Membran-gebundenen Regionen, die unter der Kontrolle der endogenen regulatorischen Elemente.
Um zu testen, die insertion und expression von emAb (entwickelt monoklonale Antikörper) Kassetten, untersuchten die Wissenschaftler Ihnen in einem Burkitt-Lymphom abgeleitet B-Zelllinie, die nativ exprimierten Membran-gebundenen Antikörper. Sie analysierten das Genom mit der CrispRGold Algorithmus zu identifizieren, die mehrere potenzielle Cas9 guide RNA-binding sites zu implementieren, die beabsichtigte Gentechnik. Die Wissenschaftler haben zunächst electroporated der Zelllinie precomplexed mit der Cas9-protein für eine effiziente DNA schneiden. Dann inkubierten die Zellen mit dem adeno-assoziierten virus (AAV), die codierte eine technische RSV-emAb-Kassette abgeleitet von Palivizumab (monoklonaler Antikörper entwickelt für respiratorische Syncytial-virus (RSV).
Der Wissenschaftler entwickelt, die versuche nur mit Zellen zu binden, die den respiratory-synctial-virus (RSV) antigen, wenn die RSV-emAb-Kassette werden konnte, erfolgreich eingefügt in die IgH-locus. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie, die Sie dann bewertet RSV-emAb-expression in der Oberfläche der Zelle und die Ergebnisse zeigten, dass die emAb-engineering neu programmiert auf die B-Zellen mit einem funktionellen, monoklonale Antikörper.
Im nächsten Schritt, Moffett et al. hergestellte menschliche primäre B-Zellen mit Zell-expansion und-Differenzierung, vor der Elektroporation mit gRNA/Cas9. Testen Sie die Leistung des emAb-backbone über mehrere, unabhängig voneinander abgeleiteten Antikörper, die Wissenschaftler entwickelt drei weiteren emAb-Kassetten-encoding aufgeführten Antikörper, neben mock engineered control B-Zellen.
Die Wissenschaftler konnten zeigen, dass die flexible Natur des emAb-Plattform-Ingenieur B-Zellen produzieren und sezernieren schützenden monoklonalen Antikörpern. Gefolgt von experimentellen setup-Optimierung, um auszudrücken, sowohl der IgH-loci über Gentechnik.
Nach Abschluss der Experimente zu konstruieren primären B-Zellen in vitro, die Wissenschaftler als Nächstes testeten Ihre Schutzwirkung in vivo in einem Maus-Modell der Infektion. Moffett et al. waren in der Lage, pflegen, serum-Antikörper-titers für 40 Tage, nach der übertragung der gene entwickelt, emAb-B-Zellen in immunsupprimierten RAG1-/- Mutanten-Maus-Modell fehlt die endogene T-und B-Zellen. Die ausgereifte Zellen geschützt, die Mäuse für 82 Tage aufgrund der Persistenz der emAb-Zellen. Jedoch werden die Zellen nicht reagieren auf eine Infektion, die die Wissenschaftler gutgeschrieben, die Abwesenheit von T-Zellen in RAG-/- Mutante Mäuse.
Da die B-Zellen wurden so entwickelt und kultiviert im Labor, Sie kann nicht erworben haben, die Eigenschaft von Gedächtnis-B-Zell-Bildung zu reagieren, unabhängig von der Hilfe von T-Zellen und verhindern, dass die Infektion im Tiermodell. In der Zukunft werden daher, Moffett et al. beabsichtigen, pre-select-B-Zell-Untergruppen reduziert die Abhängigkeit von T-Zellen zur Verbesserung der Zell-Reaktion auf eine Infektion.
Die translationale Experimente gemacht in den immundefizienten Tier-Modelle vertreten die Krankheit, die Mechanismen beobachtet, die mit immungeschwächten hämatopoetischen Stammzellen-Empfänger, die sind anfällig für Infektion nach der Transplantation. Moffett et al. vorstellen engineering emAb-Zellen für die infusion, um den Gegner RSV -, EBV -, HMPV (Humanes Metapneumovirus) und CMV (Zytomegalievirus) und lindern/umgehen Mechanismen der Krankheit. Parallel dazu sind die Wissenschaftler arbeiten auch in Richtung unter Umgehung von Patienten-spezifischen in-vitro-Zell-Vorbereitung zu bieten adoptiver Zelltherapien mit universal-Spender-Zellen-Produktion und nanocarrier driven transport von primären Zellen in vivo zu ermöglichen eine effiziente Antikörper-Lieferung.