Beleuchtung Proteine mit Immun-SABER
Um besser zu verstehen, wie Gewebe und Organe entwickeln, die nicht funktionieren und regenerieren im Laufe der Zeit, würden die Wissenschaftler gerne zu visualisieren Ihrer konstituierenden Zellen Repertoire von Molekülen in 3D-Raum. Ambitionierte Projekte wie die „Menschliche Biomolekulare Atlas-Programm“ der „Menschlichen Zelle, Atlas-Projekt,“ und mehrere Hirn-atlas-Projekte sind im Gange, um anzeigen der Präsenz und der fülle der vielen Proteine-die Produkte der gen-expression-in den Organen und Geweben des menschlichen Körpers auf der Ebene der einzelnen Zellen. Jedoch, die bestehenden bildgebenden Verfahren sind in der Regel begrenzt in die verschiedenen Aspekte Ihrer Leistung, Ihrer Erreichbarkeit für die Forscher, oder beides.
Wie berichtet in Nature Biotechnology, ein team unter der Leitung von Peng Yin, Ph. D., an der Harvard Wyss Institut für Biologische Engineering und an der Harvard Medical School (HMS) hat nun füllte diese leere mit einem neuen DNA-Nanotechnologie-basierten Ansatz namens Immuno-SÄBEL, kurz für „Immunfärbung mit Signal-Amplifikation Durch austauschreaktion.“ Die Methode kombiniert das protein-targeting-Spezifität von allgemein verfügbaren Antikörper mit einem DNA-basierten signal-Amplifikation-Strategie, die es ermöglicht, die hoch-Multiplex-Visualisierung vieler Proteine in der gleichen Probe mit pre-programmierbaren und einstellbaren Fluoreszenz-Signale an jedes Ziel-site. Das team überprüft hat, Ihre Methode in einem breiten Spektrum von Zell-und gewebepräparaten.
„Wir haben gezeigt, dass Immun-SABER bietet die Möglichkeit, eigenständig Stimmen Sie die signal-Intensität für einzelne protein-targets 5 bis 180-Fach, mit multiplexing-Fähigkeit erlauben die simultane Detektion vieler Proteine. Zusammen mit seiner Geschwindigkeit, relativ einfacher Bedienung und niedrigen Kosten, ist diese Technik das potential hat, schnell vorwärts Laufenden large-scale-protein-mapping-Studien und biomarker-Entdeckung-Bemühungen in vielen Geweben und Krankheiten“, sagt Peng Yin, der ein Wyss-Institut-Kern-Mitglied der Fakultät.
Auf der Grundlage seiner Gruppe die Fortschritte in der Nutzbarmachung der DNA-Nanotechnologie-driven-barcoding und Signalverstärkung Technologien, Yin vor kurzem wurde kürzlich auch ausgewählt als Preisträger des Menschlichen Biomolekulare Atlas-Programm (HuBMAP) und ein Preisträger der Menschlichen Zelle-Atlas-Projekt. Außerdem ist er co-Leiter der Wyss Institut der Molekularen Robotik-Initiative und Professor für Systembiologie an der HMS.
Antikörper sind die häufigsten Nachweisreagenzien für Proteine, die sowohl in der Forschung und klinischen Einstellungen. Sie sind in der Regel markiert mit fluoreszierenden Flecken, um Sie nachweisbar durch Mikroskopie. Jedoch, konventionelle Antikörper-Färbung Methoden in der Regel erlauben nur ein maximum von fünf verschiedenen Flecken gleichzeitig verwendet werden, und target-Proteine unterscheiden sich erheblich in Ihrer Zusammensetzung, so dass es schwierig zu unterscheiden, seltene protein-targets mit hoher Empfindlichkeit von der hintergrund-Fluoreszenz, die viele Gewebe-display.
Immuno-SÄBEL nutzt die „Primer-Reaktion“ (PRO) – Methode bereits berichtet, die durch Yin-Gruppe zu synthetisieren lange concatemers von kurzen DNA-primer-Sequenzen mit Hilfe einer katalytischen DNA-hairpin-Struktur. Die PRO-generiert concatemers angeschlossen sind, über kurze Griff-Sequenzen, die über DNA-barcodes auf Antikörper binden an bestimmte Proteine in fixierten Zellen und Gewebeproben mit hoher Spezifität. Auf der Ziel-site, SABER concatemers bieten ein Gerüst mit mehreren Bindungsstellen für die komplementäre fluoreszierende Oligonukleotide („Imager“), und somit ein Mittel zur Verstärkung des Signals, die von jedem protein-Ziel.
„Durch barcoding-Antikörper mit einzigartigen kurzen DNA-Sequenzen und die Anwendung Immuno-SABER, können wir gleichzeitig visualisieren mehrere protein Ziele, die auf der gleichen Probe und mit hoher Spezifität. Dies ist im wesentlichen öffnet einen Weg zur Analyse der protein-Vielfalt vorhanden im Gewebe in einem robusten und Multiplex-Mode,“ sagte der co-und co-corresponding author Sinem Saka, Ph. D., arbeitet als Postdoctoral Fellow an Yin ‚ s team.
Das team deutlich verstärkt, die multiplexing-Potenzial Ihrer Immuno-SÄBEL-Ansatz durch die Kopplung Sie mit Ihren bereits früher entwickelte „DNA-Austausch“ – Technik. In der DNA-Austausch, Imager, dass mark ein Satz von target-Proteine werden durch waschen entfernt und ersetzt durch einen anderen Satz von Imager-Kennzeichnung eine andere Gruppe von target-Proteinen, und dies kann mehrfach wiederholt werden.
Bisher entwickelten Methoden für hoch-Multiplex-protein-Erkennung, die Arbeit zu wiederholen, die einige Ihrer wichtigsten Schritte, die zu unterschiedlichen protein-targets neigen dazu, leiden unter nicht optimalen Empfindlichkeiten, oder viel Zeit in Anspruch nehmen (geringer Durchsatz) und finesse zu führen. „Exchange-SÄBEL“ – bietet eine hohe Empfindlichkeit mit einem einzigen Schritt zu färben und Verstärkung, und die high-multiplexing und-Durchsatz mit mehreren fast-imager exchange-Schritte“, sagte co-Erstautor Yu Wang, wer ist ein student auf Yin ‚ s team. „Als proof-of-concept, wir bildeten 10 verschiedene Proteine in cryosections von der retina der Maus.“
Wang war co-betreut von co-Autor George Church, Ph. D., ein Kern-Mitglied der Fakultät an der Wyss Institut und Professor für Genetik an der HMS und der Gesundheits-Wissenschaften und Technologie an der Harvard Universität und dem Massachusetts Institute of Technology (MIT).
Eine weitere wichtige Facette der Immuno-SABER erleichtert die parallele Detektion von vielen Proteinen gleichzeitig ist seine Fähigkeit, tune-signal. Das team erreicht dies durch die Montage komplexer verzweigte Strukturen, die von PRO-generiert concatemers enthalten eine höhere Anzahl von Bindungsstellen für Leuchtstoff-Imager. „Die Programmierung der Komplexität der PRO-basierten concatemer Strukturen ermöglicht uns die Feinabstimmung der Signalstärke, um die fülle der bestimmten Proteine. Wir können zur gleichen Zeit zu visualisieren selten Proteine mit verzweigten SABER Produkte, mit denen höhere Signalverstärkung und reichlich Proteine mit linearen SABER Produkte“, sagte Saka. In Ihrer Studie, das team kombinierte lineare und verzweigte SABER concatemers, zum Beispiel, gleichzeitig zu visualisieren sechs protein-targets mit unterschiedlichen Häufigkeiten und zelluläre Standorten in human tonsil Proben.
Yin ‚ s team die vorhandenen suite von DNA-Nanotechnologie-powered-imaging-Technologien, einschließlich DNA-FARBE und Diskrete Molekulare Bildgebung, erweiterte den Bereich der super-resolution-Mikroskopie, die es erlaubt Forschern zur Untersuchung einzelner Moleküle an Ihre normalen Standorte. Erreichen ähnlich hohe Auflösung von Proteinen in komplexer Gewebe-Umgebungen das team kombinierte Immuno-SÄBEL mit einer Methode bekannt als „Erweiterung der Mikroskopie,“ das war früher entwickelt, die von co-Autor Edward Boyden, Ph. D., der Y. Eva Tan Professor in Neurotechnologie am MIT. Die expansion Methode schwillt Feste Gewebe künstlich zu größeren Mengen, die Erhöhung der Abstand zwischen den einzelnen Molekülen und verbessert damit Ihre effektive Auflösung, ohne die Notwendigkeit für spezialisierte Instrumente. „Durch die Kombination von Ausbau-Mikroskopie mit Exchange-SÄBEL gleichzeitig gibt uns die high-multiplexing, -Durchsatz und -Auflösung-Fähigkeiten erforderlich, um Bestrebungen wie die Gebäude molekulare Atlanten für den menschlichen Körper effektiver vorangetrieben werden“, sagte Wang.
„Peng Yin‘ s-team zeigt sich erneut, wie Sie das Programm entwickelt, die DNA-Moleküle zur Durchführung bestimmter Aufgaben wie die molekulare Roboter, in diesem Fall ermöglicht uns die Visualisierung, die gleichzeitig die Lage zahlreicher Proteine in menschlichen Zellen und Geweben mit hoher Auflösung, das sollte deutlich beschleunigen Entdeckung der molekularen Mechanismen der biologischen Kontrolle sowie neue Biomarker der Krankheit,“ sagte Wyss-Institut-Gründungsdirektor Donald Ingber, M. D., Ph. D., der auch der Judah Folkman Professor für Vaskuläre Biologie an der HMS, die Vaskuläre Biologie-Programm an der Boston-Kinderklinik, und Professor für Bioengineering an der Harvard ‚ s John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences (SEAS).