Eine neue Sequenzierung-Methode zum erkennen von DNA-Modifikationen von Relevanz zu Krebs
Ludwig-Krebs-Forschungs-Wissenschaftler berichten in der aktuellen Ausgabe von Nature Biotechnology eine neue und verbesserte Methode zum Nachweis chemischer änderungen an der DNA. Diese Veränderungen-oder „epigenetische“ Markierung — helfen, die Kontrolle der gen-expression und Ihre aberrante Verteilung über das Genom trägt zur Krebs-progression und therapieresistenz.
Angeführt von Chunxiao Song und Benjamin Schuster-Böckler, beide assistant Mitglieder des Ludwig Institute for Cancer Research, Oxford, die Studie zeigt, dass Ihre Methode, genannt TET-assisted-pyridin-Boran-Sequenzierung, oder HÄHNE, ist weniger schädlich und effizienter Ersatz für bisulfite Sequenzierung, der aktuelle gold-standard für die Kartierung von epigenetischen Modifikationen der DNA.
„Wir denken, WASSERHÄHNE ersetzen Sie direkt bisulfite Sequenzierung als einen neuen standard in epigenetische DNA-Sequenzierung“, sagte Song. „Es macht epigenetische DNA-Sequenzierung erschwinglich und zugänglich für ein breiteres Spektrum akademischer Forschung und klinische Anwendungen.“
Eine Klasse von epigenetischen Modifikationen beinhaltet die Anlage von chemischen Gruppen, die zu einem der vier „Buchstaben“, oder Basen, der DNA. Diese Markierungen verändern nicht die DNA-Sequenz selbst, sondern vielmehr Einfluss auf die an-und abschalten von Genen. Zwei der häufigsten Modifikationen dieser Art beinhalten die Zugabe von chemischen methyl-und hydroxymethyl-Gruppen an Cytosin zu erstellen, die 5-methylcytosine (5mC) und 5-hydroxymethylcytosine (5hmC). „Abnormale Muster von 5mC und 5hmC überfluss sind die klassischen Markenzeichen der Krebs,“ Song gesagt.
Seit Jahrzehnten sind Biologen stützte sich auf die-bisulfite zu erkennen, 5mC und 5hmC änderungen, aber die Chemie ist extrem zerstörerisch, erniedrigend, so viel wie 99% der DNA-Kontakte. „Sie können sich vorstellen, dass, wenn Sie Umgang mit sehr begrenzten genetischen Proben, wie cell-free DNA zirkuliert im Blut, bisulfite Sequenzierung wird sehr herausfordernd“, Song gesagt.
Eine weitere Einschränkung der bisulfite Sequenzierung ist, dass es erkennt, 5mC und 5hmC nur indirekt. Die Technik wandelt unverändert Cytosin zu einer ähnlichen base namens uracil, während methylierte Cytosin intakt. „Das ist sehr ineffizient und Berechnung intensiv,“ Song gesagt. „Es ist wie die Suche nach Waldo durch den Wegfall jeder, der nicht Waldo. TAPS können, uns zu finden, Waldo direkt.“
Die neue Methode beinhaltet zwei Schritte. Die erste verwendet ein Enzym, bekannt als TET zu konvertieren 5mC und 5hmC zu einer Dritten änderung, 5-carboxylcytosine (5caC). Der zweite Schritt beinhaltet eine neue Chemische Reaktion, entwickelt von Liu Yibin, ein Postdoc-Forscher in der Song ‚ s lab zu konvertieren 5caC in Thymin — eine DNA-base, die gelesen werden kann, die von gewöhnlichen Sequenzierung Maschinen.
Der Prozess erzeugt eine neue Art von Daten, und das Labor von Schuster-Böckler entwickelt computergestützte Methoden, die für Ihre Analyse. „Im Vergleich zu bisulfite-sequencing, Bearbeitung TAPS-Daten nicht nur doppelt so schnell, er behält auch viel mehr Informationen aus der ursprünglichen Probe. Dies macht es viel leichter zu erkennen, Mutationen und strukturellen Veränderungen, auch während die Identifizierung der DNA-Modifikationen, die“ Schuster-Böckler, sagte.
Nach der Demonstration, dass die Kern-Chemie der TAPS gearbeitet, das team verbrachten ein Jahr perfektionieren, wodurch die Effizienz der Reaktion von über 70% auf über 95%. Die Forscher entwickelten zwei Varianten des ARMATUREN-Technik — ARMATUREN-Beta-und CAPS-die verwendet werden können, um zu erkennen, nur 5mC oder 5hmC, beziehungsweise.
In tests mit Maus-DNA zeigten die Forscher, dass TAPS erzeugen kann, genauer Sequenzierungs-Daten an die Hälfte der Kosten bisulfite Sequenzierung. „Wir können doppelt so viel nützliche Daten für die gleiche Menge an Geld,“ – Song gesagt.
Song, Schuster-Böckler und Kollegen sind jetzt Veredelung WASSERHÄHNE zu analysieren, cell-free DNA-Schuppen, die von Tumoren in die Blutbahn mit dem Ziel, die Anwendung der Technik zu entwickeln, minimal invasiven Krebsdiagnostik.